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> Center Introduction > 연구내용 > Chronic hypoxia |
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| Chronic
hypoxia |
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심혈관계와
호흡기계는 산소의 항상성 유지에 있어 중요한 기능을 담당한다. 저산소 상태에서 세포는
여러 가지 단백들이 변화하여 생리적인 현상을 일으키게 되는데, 여기에는 hypoxia
inducible factor-1 (HIF-1)라는 전사조절인자가 관여하여 생리적인 반응을
조절한다고 알려져 있다. 이러한 중요한 기능 때문에 치료학적으로도 매우 중요한 의미를
지니고 있다.
현재까지 진행되어 온 HIF-1에 대한 많은 연구들은 HIF-1이 저산소증에 대한 세포의
자가적 회복이외에도 세포의 대사(metabolism), 증식(proliferation),
생존(survival) 등에 관여하는 유전자들의 활성 및 조절에도 중요한 역할을 한다고
알려져 있다. 그 중에서도, 현재 많은 연구자들이 관심을 가지고 연구를 하고 있는 것이
종양에 대한 치료적인 측면에서의 HIF-1연구이다. 하지만, 이러한 연구들을 실시하면서
현재까지 진행되어온 실험적 방법은 모두 일정한 시점이 지난 뒤에 세포를 죽여서 관찰하는
방법(RT-PCR, Western blot, Immunocytochemistry 등)을
통한 관찰이 주를 이루어왔다.
이로 인해, 실제적으로 세포 내에서 이루어지는 생리적신호를 실시간(real time)으로
관찰하거나 연속적인 원인과 결과를 도출해내는 데에는 그 한계를 지니고 있다. 이러한 한계점
등이 결국 임상 모델동물 통한 실험으로의 발전을 더디게 하는 요인이라고 할 수 있다. |
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| 본
연구에서는, in vivo와 가장 가까운 초대배양세포를 이용하여 표적유전자나 생체신호전달물질을
세포 내로 유입 시켜 가시화하고, 세포가 외부자극에 대하여 반응하는 신호전달의 일련의
과정을 세포가 살아있는 상태에서 관찰하여, 궁극적으로는 좀 더 임상연구에 가까운 실험모델을
개발함으로써, 인간으로의 치료학적 적용을 앞당기는 것을 목표로 한다. |
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| 저산소증 상황에서 HIF-1에
의해 매개되는 이온채널의 변화를 관찰하고 그 기전을 밝히기 위해서 다음과 같은
단계적인 실험절차를 걸친다. |
PRIMARY CELL CULTURE |
동물이나 사람으로부터
분리된 혈관 및 심장세포를 초대배양(primary
cell culture) 한다(그림 1).
경우에 따라서는, 각 장기유래의 세포주
(예, 심장: H9c2, 혈관: BAEC 등)도
병용한다. |
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| TRANSFECTION
or VIRAL INFECTION |
형광 단백이나 발색물질을
융합 시킨 표적유전자를 유전자 도입용 시약(transfection
reagent)이나 바이러스의 세포 내 침입을
응용한 유전자 도입용 바이러스 벡터(viral
vector) 등을 이용하여 세포 내로 유전자도입
한다.
- HIF-1alpha와 GFP를 융합(fusion)
시킨 발현벡터(expression vector)를
초대분리 배양한 심근세포(atrial myocytes)나
혈관세포(vesicular smooth muscle
cells or endothelial cells),
혹은 특정장기유래의 세포주에 |
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<그림1> Rat atrial myocytes의 primary culture |
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| 그림 3 저산소증의 시간적 경과에 따른
HIF-1alpha의 발현과 patch clamping transfection
reagent(예, FuGene6)를 이용하여 유전자도입하고, G418을
함유한 배지를 통해 선택 배양하여 원하는 세포주(clones)를
얻어 낸다. |
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| <그림2>
산소증에 의한 HIF-1alpha의 발현과 핵 내로의 translocation
확인 |
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| <그림3>
저산소증의 시간적 경과에 따른 HIF-1alpha의 발현과 patch
clamping |
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| CHARACTERIZATION |
Imaging system을 통하여 표적유전자의
발현을 확인하고, 용액의 조건이나 약물반응을 주어 이에 따른 세포
내 신호의 변화를 실시간으로 관찰한다 (그림2, 3).
그 예비 결과로서 4-AP-sensitive K+ currents를
저산소증의 시간적 경과에 따라 관찰하였다(그림 4).
용액 중의 산소의 함량을 1%이하로 낮추거나, HIF-1alpha의
세포질 내 분해를 차단시키는 약물의 일종인 ciclopirox olamine
(CPX)를 처치하여 HIF-1alpha의 핵 내로의 이동과 표적유전자
전사활성(transcription up-regulation)을 유도하고,
RT-PCR이나 표적유전자 tracing 등을 통해 HIF-1에
의한 표적유전자 조절기전을 확인한다. 이러한 mRNA screening의
표적유전자로서는 만성 저산소증 상황에서 활성화되는 channel
protein, apoptosis 또는 종양형성에 관여하는 후보유전자
등을 그 대상으로 한다. |
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| MODELING
or DEVELOPMENT |
위의 실험을 바탕으로 in vivo model
(transgenic 또는 knock-out/down animal)을
설계/개발하여 보다 효과적이고 유용한 임상실험을 실시한다.
- 저산소증에 대하여 sensor역할을 담당하는 채널단백을 밝히고,
이것의 기능을 결손 시킨 동물모델을 개발하여,
저산소성 질환에 대한 치료제의 개발에 응용한다.
- 종양과 관련하여 세포사 기전에 결정적인 역할을 담당하는 세포
내 molecule의 신호전달과정을 규명하고, 이러한
molecule의 활성을 조절하는 유전자를 바탕으로 제작된 모델동물의
실험을 통해 종양형성에 저항성을 나타내는
유전적
형질을 규명하고 종양예방 및 치료에 활용한다. |
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| <그림4>
H9c2 세포주의 저산소증에 따른 4-AP-sensitive K+
currents의 시간적 변화 관찰 |
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Archer
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